LABORATORIO: IDENTIFICACION BACTERIANA

L. mejia y J. Montes
2 oct 2016
9 Min. de lectura

*El siguiente la resolucion de un cuestionario acompañado de una practica de laboratorio diseñado por el departamento de Microbiologia y resuelto por dos estudiantes de medicina , esperamos que sea de su utilidad. Los comentarios y sugerencias son bienvenidos*

El laboratorio clínico es el espacio de procesamiento de muestras biológicas del paciente para su estudio y diagnóstico de una enfermedad infecciosa. Para llevarlo a cabo, el médico tratante debe realizar un diagnóstico presuntivo según la exploración e historia clínica del paciente y consignar en una orden de solicitud la información adecuadamente para que el laboratorio pueda determinar el procedimiento a seguir. La muestra en este caso será estudiada a partir de siembras en medios de cultivos, que son determinados para el aislamiento de ciertos microorganismos. En las primeras dos practicas llevadas a cabo se identificarán los agentes etiológicos según género y especie, para establecer el diagnóstico más acertado según corresponda.

CULTIVOS

Técnicas de siembra y su utilidad: Se emplea un asa previamente esterilizada para tomar una pequeña fracción de muestra del paciente y ubicarla dentro de un recipiente que tendrá un medio (solido, semisólido o líquido) en el cual los microorganismos presentes en la muestra tengan posibilidad de crecimiento, este medio puede estar enriquecido para favorecer la nutrición de ciertos microorganismos.

Siembra por estría: se realiza en medios solidos como el Agar, puede ser en un tubo de ensayo con el agar inclinado o en caja de Petri. Se emplea un asa redonda para distribuir la muestra en la superficie del agar y poder visualizar el crecimiento de colonias posteriormente. Se realiza a partir de la muestra tomando una pequeña cantidad con el asa y suavemente se deslizará una sola vez en forma de estría (en zigzag) sobre el medio. Utilidad: Es usada principalmente para aislar cepas puras o para obtener colonias aisladas en una placa de Petri a partir de un inóculo o muestra con diferentes especies, el último patrón debería depositar un número bajo de células para poder considerarse “puras”. (1)
Siembra por punción. Se emplea un asa recta, la cual una vez tomada la muestra con ella deberá atravesar el medio una sola vez y hasta la mitad del medio. Esto se hace con mayor frecuencia en tubos de ensayo con agar inclinado. Utilidad: Este método se utiliza principalmente para observar y evaluar el movimiento de las bacterias. (1)
Siembra de estrías por agotamiento: Se emplea un asa redonda con la cual una vez tomada la muestra se va a dibujar una primera línea en zigzag sobre la superficie del agar, a partir de esta se va dibujando un estría en el siguiente cuadrantes de la caja, luego una tercera a partir de la anterior hasta finalmente tener en la cuarta línea. Utilidad: La cuarta línea corresponderá a un cultivo aislado de microorganismos puesto que se ha ido ‘limpiando’ el asa sobre el agar en las líneas anteriores y perdurará en esta última aquel microrganismo que este en mayor proporción en la muestra. (1)
Siembra en medio liquido: se toma una fracción de muestra con el asa y se sumerge con movimientos rotativos dentro del tubo de ensayo que contiene el medio líquido. Utilidad: La utilidad o finalidad del método es poner la bacteria en suspensión. (1)

FARINGOCULTIVO:
Descripción: está diseñado para la comprobación de bacterias en la garganta. Es de gran utilidad especialmente para el diagnóstico, manejo y seguimiento (respuesta a tratamiento antibiótico) de la faringitis estreptocócica o en caso de inflamación de la epiglotis.

Método: con ayuda de un hisopo (copito de algodón de mango largo) se frota (una vez o un par de veces hasta obtener muestra) la parte posterior de la garganta o la superficie de las amígdalas. La boca del paciente debe estar completamente abierta mientras se realiza el procedimiento, aunque esto pueda resultar incómodo, esto se debe aclarar previamente para evitar que el paciente cierre la boca mientras el hisopo se encuentre dentro de la cavidad. La duración de la toma de muestra debe ser usualmente corta. Se retira el hisopo y luego se siembra la muestra sobre el agar. El paciente no requiere preparación especial previa o posterior al examen. (2)

Ventajas y relación clínica:

El cultivo faríngeo sigue siendo el procedimiento estándar para confirmación de presencia de estreptococos beta hemolíticos del grupo A en el tracto respiratorio superior. Esto es importante debido a que la faringitis es una enfermedad común entre los 5 a los 15 años de edad, que habitan en climas temperados y con mayor frecuencia en invierno. Síntomas de faringitis estreptocócica aguda: cefalea, nausea, vómitos, dolor en la garganta de establecimiento repentino, dolor al tragar y fiebre. En niños también se puede observar dolor abdominal. Al examen clínico puede observarse eritema tonsilofaringeo con o sin exudado, linfadenitis cervical, úvula enrojecida, petequias en el paladar entre otros. Haciéndolo correctamente tiene una sensibilidad hasta de 95%. El cultivo faríngeo es afectado por distintos factores como la manera de obtención de la muestra, pues es estrictamente necesario que se obtenga de la superficie de las amígdalas o la pared laríngea posterior, son lugares que previo a la obtención de la muestra NO deben ser tocados o manipulados por el personal de laboratorio o por el paciente debido a que esto modificara los resultados del cultivo. Otros lugares faríngeos no suelen ser aceptables para la toma de la muestra pues podrían no resultar significativos generando mayor probabilidad de falsos negativos. (3)

Desventajas:

Suele ocurrir que para la obtención de resultados resulta ineficiente pues requiere de horas para que se pueda evaluar la presencia de los microorganismos de importancia. En niños la obtención de la muestra puede ser más complicada debido a la sensibilidad o poca disposición para el examen. (3)

Transporte de la muestra:

En caso de ser requerido un medio de transporte hasta el laboratorio se lleva el hisopo con medio de transporte bacteriano: Medio de transporte Stuart Agar gel o Amies, los cuales se usan para la recolección, transporte y preservación de muestras clínicas aptas para exámenes bacteriológicos. Es útil para mantener la viabilidad de algunos microorganismos de difícil desarrollo. Se mantiene a temperatura ambiente y se recomienda entregarlo a laboratorio en menos de 2 horas. Sin embargo el plazo máximo tiene un límite de 24 horas. (2)(4)

Microbiota normal en cavidad oro faríngea:

Microbiota normal de la cavidad oral:

Suele ser de tipo mixto, con asociación de gérmenes aerobios y anaerobios. Las bacterias que se adhieren a la superficie dental en forma permanente y a través de diferentes polímeros de origen bacteriano como dextranos y levanos. El contenido de gérmenes anaerobios es máximo a nivel del surco gingival. Composición: Predominan diferentes especies de Streptococcus α hemolíticos. Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis en la placa dentaria. Streptococcus mitis se adhiere tanto a los dientes como a las mucosas;

S. salivarius predomina en la mucosa lingual. Entre los gérmenes anaerobios Gram positivos: Actinomyces sp. a nivel de la placa, y en baja cantidad Lactobacillus. La mayoría de los Gram negativos son anaerobios. También pueden encontrarse espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram positivos anaerobios como Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, entre otros. Pueden además aislarse especies de Mycoplasma y levaduras como Cándida. (5)

Flora del aparato respiratorio superior (fosas nasales y faringe): En el sujeto normal solamente el árbol respiratorio alto (fosas nasales y faringe) presenta microbiota normal; los senos paranasales, oído medio, tráquea, bronquios pulmonares y pleura son estériles. A nivel de la faringe podemos encontrar principalmente Streptococcus α hemolíticos. Además diferentes especies de Lactobacillus, Propionibacterium, Corynebacterium, Moraxella, entre otros. Anaerobios suelen ser 10 veces más que los aerobios, pueden ser Peptoestreptococcus spp., Actinomyces spp. En las fosas nasales se encuentran gérmenes de tipo cutáneo: Staphylococcus epidermidis y especies de Corynebacterium. Alrededor del 30% de los sujetos son portadores sanos de Staphylococcus aureus a nivel nasal. En preescolares es habitual la colonización por Streptococcus pneumoniae y especies de Haemophilus. Los bacilos Gram negativos que se encuentran en general son Fusobacterium spp. y Bacteroides spp. A nivel de las criptas amigdalinas se produce acumulación de materia orgánica, disminuye el potencial redox y el número de anaerobios puede ser muy elevado. Cierto porcentaje de individuos alberga S. pneumoniae y Haemophillus influenzae sin presentar enfermedad. También pueden encontrarse especies no patógenas de Neisseria y Streptococcus ß hemolíticos diferentes al grupo A. En condiciones normales no existen bacterias más allá de la glotis. (5)

Importancia de la siembra de secreción faríngea en agar sangre y agar chocolate: La secreción faríngea es importante para determinar en qué medio de cultivo se debe realizar la siembra, dependiendo si el microorganismo bajo sospecha es anaerobio o aerobio, cuáles son sus requerimientos nutricionales y si la colonia toma un aspecto que pueda ser diferencial. (6)

- Agar sangre: Es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con fuente proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cual tiene un agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de Agar) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono naturales y cloruro sódico. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia). Normalmente se realiza la siembra de secreción faríngea en este medio cuando el microorganismo que se quiere aislar es aeróbico. (6)

- Agar chocolate: Es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es una variante del agar sangre. Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este agar se usa cuando se sospecha la presencia de un gonococo o de un meningococo, para lo cual se precisa una atmósfera ligeramente anaerobia o alta concentración de CO2. (6)

Solicitud para faringocultivo: La solicitud analítica es el medio de entrada de los pacientes en el Proceso de Laboratorios Clínicos. La solicitud analítica debe incluir aproximadamente los siguientes ítems, aunque varía de acuerdo a cada país o región. (7)

Así mismo el reporte de los hallazgos hechos en el laboratorio de microbiología se reportan con los siguientes datos:

PARTE II

Objetivos:

Estudiar las características macroscópicas de una bacteria en un medio de cultivo
Estudiar los cambios producidos en los diferentes medios
Preparar frotis en láminas portaobjetos, a partir de cultivos bacterianos en medio líquido y en medio sólido
Aprender a realizar la coloración de Gram
Conocer las diferentes características morfológicas bacterianas
Conocer los diferentes tipos de agrupación bacteriano
Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
Conocer cultivos mixtos
Aprender a distinguir los tipos de hemólisis

INFORME: “Faringocultivo”

Investigue por qué algunas bacterias no crecieron en Agar Mac Conkey y las crecen, por qué se diferencian en lactosa positivas y lactosa negativas?

El agar Mac Conkey es un medio de crecimiento selectivo para gram negativos y tiene carbohidratos de lactosa para poder observar crecimiento diferencial entre fermentadoras de lactosa y no fermentadoras de lactosa. se confirma la fermentación de lactosa cuando éste forma precipitados y cambios de coloración rojiza en la estría de siembra.

Escriba 5 medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiología para el aislamiento bacteriano en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y, la utilidad de cada uno de ellos.
Caldo Selenito: enriquecido para E coli, en muestras de materia fecal. (6)
Agar XLD: puede dectectar bacterias no fermentadoras no productoras de ácido sulfhídrico como salmonellas; en muestras de materia fecal. (6)
TSI (triple azúcar-agar): es un medio especial para diferenciar bacterias según su metabolismo: fermentación de distintos azucares (glucosa, lactosa y sacarosa) y producción de gases (aerogenicas / anaerogenicas). Por ejemplo: Salmonella, Shigella, E.coli. (6)
Thayer Marten: contiene antibióticos para inhibir crecimiento de algunos microorganismos y permite solo la detección de Neisseria gonorrea. (6)
Agar Levine o “Eosina – Azul de Metileno” (EMB): es utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos Gram Negativos (G-). Este medio permite diferenciar al género Salmonella, y otros microrganismos Lactosa Negativos, de organismos coliformes. (6)

Portador Sano: También denominado portador asintomático, el portador sano es el nombre que se le atribuye a un individuo que lleva en su organismo un agente infeccioso que no le provoca ningún síntoma. Esta situación particular se puede explicar por el hecho que el agente no es muy virulento o porque el individuo tiene un buen sistema de defensas inmunitarias que son suficientes para controlarlo. Sin embargo, el portador sano es un vector de transmisión del microbio a otros individuos. (8)
Importancia de cultivo faríngeo en personal de servicios de alimentos:

En Colombia según la normatividad actual las personas que son MANIPULADORES DE ALIMENTOS deben tener un certificado médico para proceder a la manipulación de comidas y bebidas debido a que es de importancia para la salud de toda la comunidad la minimización de riesgo para transmisión y adquisición de microorganismos patógenos a través de rutas oro-fecales. Se suelen ordenar Frotis Faríngeo con Cultivo, KOH de uñas, y Coprológico. (9)
Los manipuladores de alto riesgo son aquellos que mantienen contacto directo con los alimentos que no sufren un tratamiento posterior antes de llegar al consumidor. También son aquellas personas que intervienen en la elaboración de alimentos.
Los de bajo riesgo mantienen contacto con el alimento que sufrirá un proceso de elaboración posterior antes de llegar al consumidor.
Una enfermedad alimentaria se transmite cuando se consume un alimento contaminado, el cual se genera debido a una mala manipulación.(9)
En las personas los gérmenes o bacterias se pueden encontrar en las manos, boca, nariz, aparato digestivo, y en las heces, etc. Resultados bacteriológicos negativos para los exámenes de secreciones nasofaringeas en cuanto a estafilococos aureus, streptococos befa hemolítico y difteria.(9)

REFERENCIAS

Jiménez A. Métodos de siembra: diferentes métodos de siembra. [Sitio de Internet]. 13 Sept 2013. Disponible en: http://metodosdsiembras.blogspot.com.co/
Osakidetza – Hospital Donostia. Toma y transporte de muestras para microbiología. Disponible en: http://www.osakidetza.euskadi.eus/contenidos/informacion/hd_publicaciones/es_hdon/adjuntos/Protocolo42MuestrasMicrobiologia.pdf
Bisno A, Gerber M, Gwaltney J, Kaplan E, Schwartz R. Practice Guidelines for the Diagnosis and Management of Group A Streptococcal Pharyngitis. Clin Infect Dis. (2002) 35 (2)
MBM. Medios de transporte. Disponible en: http://www.mbm.com.mx/copan/transporte.php
Torres M.E. Relación huésped parásito: flora humana normal. Higiene Edu. (2002) 1(13)
Casado M.C, Torrico G, Medina M. Medios de cultivo en un Laboratorio de Microbiología. 2012. pp. 13-36
Aguilera C, Aznar J, Durán M, Gascón F, De Haro T, Hortas M.L, López F, Martí F.J, Pérez V, Ramírez G, Ruiz E. Laboratorios Clínicos: procesos de soporte. Consejería de Salud. Sevilla, España. (2014); pp. 75-95
Kioskea. Portador Sano: definición [pagina web]. Marzo, 2015. Disponible en: http://salud.ccm.net/faq/20942-portador-sano-definicion
Alaix Magda Liliana. Manipulacion de alimentos. 2016. Disponible en http://www.manipulaciondealimentoscolombia.com/examenes-manipuladores